Пцр-диагностика. выявление инфекций и вирусов методом полимеразной цепной реакции

Что ждать работодателям и специалистам по охране труда в 2021 году?

Важное изменение — ввели два основных принципа охраны труда. Первый принцип базируется на предупреждении в виде управления рисками. Второй — принцип минимизации тех последствий, которые мы не смогли предотвратить. Управление такими последствиями позволит уменьшить травмы, которые могут получить работники на рабочих местах

У работодателя появятся новые обязанности, которые связаны со ст. 209 Трудового кодекса, где прописано, что работодатель должен создавать безопасные условия труда. Действующая редакция Трудового кодекса РФ не отвечает на вопрос, как создавать такие условия.

Материал для исследования и правила его забора

Для лабораторного ПЦР-исследования используют различный биоматериал в зависимости от предполагаемого заболевания. Подробнее о материалах и правилах забора, смотрите таблицу ниже.

Что выявляет анализ

Оценка методом помогает обнаружить не только проявившиеся вирусы и инфекции у человека, но также скрытые, о которых пациент даже не подозревает.

В связи с этим всем людям, желающим стать в ближайшем времени родителями, рекомендуется выполнить анализ. В ходе исследования могут быть обнаружены разные виды папилломавируса человека, микоплазмы и уреаплазмы (уреалитикум и парвум), гарднереллы и кандиды, микобактерии туберкулеза (в разной форме заболевания), вирусы гепатита, хеликобактерная инфекция, ВИЧ, герпес и цитомегаловирус.

Все вышеуказанные вирусы и инфекции легко выявляются при сдаче анализа ПЦР. К примеру, вирус папилломы может спровоцировать при некоторых ситуациях (как вариант — сильно ослабленная иммунная система) появление на теле бородавок.

Вследствие того, что данный метод оценки является особо чувствительным к происходящим процессам в организме женщин и девушек, множество причин может оказать влияние на конечный итог. Из этого следует, что анализ ПЦР на ВИЧ не считается точным способом диагностирования. Лишь в 96-98% он показывает достоверный результат, а в остальном может указывать на неверную информацию.

Диагностика инфекционных болезней  во многих ситуациях считается легким способом выявления возбудителей на начальных этапах заражения.

По вопросу расшифровки данного анализа следует обратиться к профессионалу. Требуется соблюдать все врачебные советы.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован

Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода — высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

Расшифровка результатов анализа

Расшифровка анализа ПЦР не представляет сложности. Есть лишь 2 шкалы показателя — «положительный результат» и «отрицательный результат». При обнаружении возбудителя врачи могут с 99%-й уверенностью подтвердить наличие заболевания и приступить к лечению пациента. При количественном методе определения инфекции в соответствующей графе будет указан числовой показатель обнаруженных бактерий. Только врач может определить степень заболевания и назначить необходимое лечение.

В некоторых случаях, например при определении ВИЧ-инфекции методом ПЦР, при отрицательном результате возникает необходимость проведения дополнительных обследований для подтверждения полученных показателей.

Этапы ПЦР-анализа

ПЦР-анализ состоит из следующих этапов.
1. Выделение нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК, далее — НК). На данном этапе растительную ткань гомогенизируют и выделяют тотальную НК (как определяемых патогенов, так и растения-хозяина), очищая ее от других соединений, в том числе являющихся ингибиторами ПЦР. Выделение РНК следует проводить только из свежих тканей. Этап занимает около 1-2 часов (время зависит от количества образцов).

1′ (Только для РНК содержащих вирусов). Проведение реакции обратной транскрипции. Так как вирусы растений в большей части являются РНК-содержащими, необходимо провести реакцию обратной транскрипции для наработки на матрице РНК комплементарной ДНК (кДНК). Для проведения реакции обратной транскрипции можно использовать набор производства ООО «АгроДиагностика». Время проведения этого этапа около 1 часа. Для проверки качества выделения РНК ООО «АгроДиагностика» предлагает использовать тест-систему на мРНК гена актина картофеля. Для постановки реакции обратной транскрипции можно использовать другой набор производства ООО «АгроДиагностика» — Комплект реагентов для проведения обратной транскрипции.

2. Постановка ПЦР и анализ результатов. В ходе этого этапа происходит амплификация специфического участка генома патогена (и/или внутреннего контроля). Гомогенные продукты, накопленные в ходе амплификации, можно детектировать различными способами.

При использовании тест-систем на основе ПЦР «в реальном времени» на этом этапе анализ заканчивается. Длительность всего этапа около 2 часов.

При использовании тест-систем в формате FLASH необходимо перенести пробирки в детектор «Джин» и провести детекцию. Длительность этого этапа не более 10 минут.

В случае использования тест-систем с детекций результатов методом электрофореза необходимо провести электрофоерез в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Визуализацию результатов проводят под УФ транслюминатором на длине волны 312 нм. Длительность этапа около 1 часа.

С более подробной информацией о методе ПЦР, его модификациях, особенностях и др. можно ознакомиться на целом ряде сайтов в интернете, в том числе на сайте https://ru.wikipedia.org/wiki/

Все компоненты, необходимые для ПЦР-диагностики конкретного патогена, присутствуют в соответствующих наборах. Необходимо добавить выделенную из образца тотальную ДНК или, в случае диагностики РНК-содержащих вирусов, кДНК синтезированную на выделенной из анализируемого образца тотальной РНК. Все подробности проведения ПЦР и анализа результатов имеются в прилагаемых к наборам инструкциях.

ПЦР — анализ

Часто бывает, что различные по своей природе вирусы могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. ПЦР анализ позволяет определить наличие возбудителя, даже при минимальном содержании его штаммов в биологическом материале, а в отдельных случаях, выявляет даже единичные клетки вирусов или бактерий. Определяется вирус, природа его появления, устанавливается сила его воздействия на организм и количество имеющихся микробов в организме. Эта информация важна для лечащего врача при выборе лекарственных препаратов и назначении методов лечения.

В настоящее время ПЦР тест позволяет выявлять все известные современной медицине вирусные заболевания. В том числе даже те, которые могут годами «жить» в организме человека и не проявлять себя, ожидая наиболее комфортных условий для своей «работы». Диагностика «растущих» длительное время возбудителей особенно актуальна в гинекологии и урологии.

В медицинской лаборатории «Синэво» можно пройти ПЦР — диагностику по следующим заболеваниям:

Гепатит B и C

Проведение ПЦР — диагностики необходимо здесь в силу того, что вирус гепатитов имеет продолжительный инкубационный период (до 180 дней) и достаточно серьезные последствия, вплоть до летального исхода.

ИППП

Заболевания, передающиеся половым путем: уреплазмол половых органов, хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз. Коварство заключается в том, что симптомы данных заболеваний зачастую на ранних стадиях «стерты». Эта группа заболеваний опасна тем, что может вызвать у женщин бесплодие, оказывает серьезное влияние на течение беременности, увеличивает риск развития рака шейки матки. У мужчин снижается подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, вызывая мужское бесплодие, поражается мочеиспускательный канал и развивается простатит. Увеличиваются риски заболевания генитальным герпесом, а так же ВИЧ/СПИД. Пакет 18.1 «Обследование на ИППП».

Сдать анализ рекомендуется и супругам, желающим родить здорового ребенка. Ведь только ПЦР — диагностика позволяет выявить скрытые инфекции в организме и предотвратить их проникновение в организм плода.

Герпес

Опасное и устойчивое заболевание. Зачастую болезнь не системна и протекает долгие годы в неактивном режиме. При этом возможны проявления, похожие на симптомы герпеса. Но истекают они так быстро, что не возможно точно поставить диагноз традиционным способом. Опасность герпеса в том, что он может поражать центральную нервную систему и стать причиной развития менингита и энцефалита. См. услуги ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (соскоб) и ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (кровь, качественное определение).

Тест на отцовство

Благодаря ПЦР — диагностике инфекции выявляются на начальном этапе их развития, что способствует скорейшему выздоровлению и предотвращению серьезных осложнений.

Показания для ПЦР-исследования

В большинстве случаев ПЦР-диагностику применяют у лиц с инфекционными заболеваниями с целью определения микроорганизма, вызвавшего болезнь.

Этот анализ используется в таких ситуациях:

• необходимость выявления и идентификации вирусов, бактерий, простейших при любых инфекционных заболеваниях, когда требуется точность диагностики;
• диагностика генетических заболеваний человека;
• идентификация личности путем сравнения с генетическим материалом известного происхождения;
• анализ тканей, полученных путем тонкоигольной биопсии, которые очень трудно исследовать другими методами;
• диагностика лейкозов и злокачественных опухолей;
• проведение экспериментов с приживляемостью эмбриональных стволовых клеток у животных (у людей применение таких клеток запрещено), а также выведение линий лабораторных мышей с заранее заданным генетическим заболеванием.

Перспективы применения ПЦР-реакции и ее разновидностей в медицине и биологии захватывают воображение – от испытания новых лекарств на генном уровне до создания трансгенных организмов с заданными свойствами. Работы в этом направлении ведутся в крупнейших лабораториях мира, что помогает совершенствовать метод ПЦР и на прикладном уровне, для диагностики инфекционных болезней человека.

В медицине ПЦР-метод обычно используется для диагностики и оценки эффективности лечения таких заболеваний:

• внутриклеточные инфекции, например, микоплазменная или хламидиоз;
• болезни, передающиеся при сексуальных контактах;
• туберкулез;
• вирусные гепатиты и ВИЧ-инфекция;
• инфекция Helicobacter pylori и многие другие.

Какие инфекции входят в ПЦР-12

ИППП развиваются в результате воздействия условно патогенной и патогенной микрофлоры на органы мочеполового тракта. При помощи метода ПЦР возможно обнаружить заболевания, протекающие как в острой, так и в хронической форме, а также задолго до того, как появятся первые симптомы болезни. Пациентов часто интересует вопрос о том, какие инфекции входят в ПЦР-12? Перечислим эти заболевания:

1. Гарднереллез.
2. Хламидиоз (вызванный видом хламидия трахоматис).
3. Микоплазмоз (вызванный микоплазмами хоминис или гениталиум).
4. Гонорея.
5. Кандидоз (вызванный в первую очередь грибами кандида альбиканс).
6. Уреаплазмоз.
7. Герпес 1 и 2 типа.
8. Трихомониаз.
9. Вирус папилломы человека (в том числе анализ ВПЧ 16 типа и 18).
10. Цитомегаловирус.
11. Анализ на гепатиты разных групп.
12. ВИЧ-инфекция.

Анализ на ВИЧ с помощью ПЦР позволяет обнаружить инфицирование на сроках 3-4 недель.

Показания для назначения ПЦР-12

ПЦР на двенадцать инфекций проводится при наличии симптомов воспалительного заболевания в органах репродуктивной системы либо с профилактической целью. Учитывая то, какие инфекции входят в ПЦР-12, проведение анализа может назначить уролог, гинеколог, венеролог. Распространенные причины для сдачи анализа:

Подозрительные или неприятные симптомы. К таким симптомам относятся болезненное мочеиспускание, зуд, появление сыпи, язвочек или нетипичные выделения из половых органов. Ошибочно полагать, что ИППП нельзя заразиться другими способами. Это заблуждение — партнеры могут быть здоровы и верны друг другу, а заражение произошло половым путем. Вероятность этого невелика и не превышает 5 %, но и это немало. К примеру, заразиться гонореей можно, использовав чужое полотенце. Риск возрастает при совместном проживании с носителем инфекции. Следовательно, бытовой способ заражения патогенными микроорганизмами также не стоит исключать

Важно вовремя обращаться к специалисту при любых тревожных симптомах. Период от момента заражения до возникновения первых симптомов может длиться от нескольких дней до пары неделей или даже месяцев

Но также важно помнить, что возможно и бессимптомное протекание заболевания. Большое количество половых партнеров и пренебрежение средствами барьерной контрацепции. В таком случае рекомендуется проведение ежегодной диагностики с целью выяснения, присутствуют ли в организме опасные инфекции. Проведение обследования при планировании беременности. Каждой паре перед зачатием рекомендуется сдать анализ ПЦР. Этот метод позволит выявить скрытые заболевания, которые могут быть переданы от матери ребенку при беременности и родах и предотвратить инфицирование. Бесплодие. Половые инфекции могут приводить к нарушениям фертильности. При неспособности зачатия в течение года при условиях активной сексуальной жизни без контрацепции рекомендуется сделать ПЦР на двенадцать инфекций. Операции на мочевом пузыре, простате, матке, яичниках и других органах малого таза. При хирургическом вмешательстве наличие инфекций может быть очень опасным, поскольку они могут привести к появлению осложнений после операции.

При наличии хотя бы одного из представленных выше признаков рекомендуется воспользоваться диагностикой методом ПЦР. Вовремя не обнаруженные и не пролеченные инфекционные заболевания могут приводить к появлению серьезных осложнений, таких как простатит, эпидидимит у мужчин и вагинит, аднексит у женщин. Причинами бесплодия у мужчин и женщин больше чем в половине случаев являются ИППП.

Правила подготовки к исследованию

Как берут анализ у женщин и мужчин? Изучение методом ПЦР позволяет добиться верного заключения, но тогда следует осуществить требуемую подготовку к нему. Перед сдачей анализа пациенту нельзя заниматься сексом за 24 ч до забора материала (при оценке соскоба, взятого из урогенитального тракта). Кровь нужно сдавать на голодный желудок, до сдачи материала запрещено есть и употреблять жидкость. Мочу сдают в аптечном контейнере, специалистам потребуется порция, собранная с утра. Для выявления вирусного гепатита С и ВИЧ-инфекции на диагностику берут кровь.

У женщин мазок не берут в период менструации. Его следует сдавать перед началом критических дней либо спустя несколько дней после их завершения. Перед сдачей мазка из урогенитального канала мужчины не должны осуществлять опорожнение мочевого пузыря примерно 1,5-2 ч. Перед забором материала на гонорею запрещено мыть наружные половые органы, делать спринцевание.

Мочу следует отвезти в медлабораторию через 2-3 ч после ее сбора. Результат анализа  подготовят лишь спустя 1,5-2 дня. Отрицательный результат поясняет, что во взятой биожидкости вредных микроорганизмов не имеется. Положительный итог значит, что человеческий организм инфицирован. Иногда обнаруживается здоровое носительство: указывает на преобладание опасных вирусов, отсутствуют какие-либо симптомы.

Данное состояние не лечится, хотя нужно систематически обследоваться у специалиста. Отметим: распространение инфекции на здоровых людей от переносчиков вероятно. Вдобавок инфекция может перейти в хроническую стадию.

Комплексное обследование ПЦР

Комплексный анализ ПЦР: что это такое? Это обследование методом полимезарной цепной реакции, которое включает в себя определение одновременно нескольких видов инфекций: микоплазмы гениталиум, микоплазмы хоминис, гарднереллы вагиналис, кандиды, трихомонады, цитомегаловируса, уреаплазмы уреалитикум, герпеса 1-го и 2-го типов, гонореи, папилломавируса. Цена такой диагностики колеблется от 2000 до 3500 руб. в зависимости от клиники, используемых материалов и оборудования, а также от вида анализа: качественного или количественного. Какой необходим в вашем случае – решит врач. В одних случаях достаточно лишь просто определить наличие возбудителя, в других, например при ВИЧ-инфекции, важную роль играет количественный титр. При диагностике всех вышеперечисленных возбудителей обследование называют «анализ ПЦР-12».

Общее качество данных

При анализе полученных данных удостоверьтесь, что кривые амплификации не имеют резких пиков и параллельны друг другу. Технические реплики должны быть просканированы в пределах 0,5 цикла. Значения Ct должны быть

Если экспоненциальная фаза начинается позже 35-го цикла, отбросьте данный образец из анализа, либо используйте эти данные с большой осторожностью, удостоверившись, что повторения однообразны

Если у вас нет доступа к кривым амплификации, и вам необходимо проверить достоверность результатов анализа, можно использовать значения Ct SD или ΔCt SD. Это поможет вам оценить однородность повторений. Значения ΔCt SD <0,25 являются хорошими. Это значение говорит лишь о технической точности измерений. Для большей точности необходимо делать биологические реплики.

Если все гены в ваших образцах выходят на экспоненциальную фазу слишком поздно (включая внутренний контрольный образец) и ваши данные, в целом, имеют плохой вид, следует проверить качество РНК. Низкое качество РНК – основная причина получения плохих результатов анализа. Убедитесь, что РНК не деградировала (с помощью гель-электрофореза или анализатора) и не загрязнена (проверьте коэффициенты поглощения 260/280 и 260/230).

Чем опасны урогенитальные инфекции

Как следует из самого названия, данные инфекции затрагивают мочеполовую систему человека, то есть, воспалительный процесс первоначально сосредоточен в органах и структурах урогенитального тракта, хотя в дальнейшем, при отсутствии лечения, может затронуть и другие отделы.

О том, для кого опаснее мочеполовые инфекции, — для женщин или для мужчин — ведется немало споров. Так, женщины более подвержены заражению урогенитальными инфекциями из-за особенностей женской физиологии. В то время как у мужчин некоторые опасные ИППП протекают без всяческих признаков, что значительно отсрочивает выявление и лечение болезни.

«Победителей» в данном споре нет и быть не может. Инфекционные заболевания мочеполовой сферы способны привести к хроническим воспалительным процессам; стать причиной эректильной дисфункции, простатита и бесплодия у мужчин, невозможности забеременеть (женское бесплодие) или выносить плод у женщин; вызвать поражения нервной и иммунной системы, почек, печени, спинного и головного мозга; привести к образованию злокачественных опухолей.

Что можно измерить с помощью ПЦР в реальном времени?

Если вам необходимо проанализировать экспрессию генов, ПЦР в реальном времени может показать количество мРНК в образцах. В результате реакции амплифицируется небольшой регион мРНК, с помощью олигонуклеотидов и флуоресцентного зонда (как в методике TaqMan). Амплификатор (прибор, в котором происходит ПЦР) измеряет интенсивность флуоресценции зондов в образцах на протяжении каждого цикла. На первых циклах уровень флуоресценции недостаточен, чтобы его мог детектировать прибор, но при дальнейшем прохождении реакции он возрастает многократно. Кривая амплификации имеет так называемую экспоненциальную фазу, после которой следует фаза плато.

Ct (пороговый цикл) обозначает определенный цикл реакции и представляет собой одно из ключевых значений ПЦР в реальном времени. Пороговый цикл наступает, когда график кривой амплификации переходит в экспоненциальную фазу (на этой фазе отрезок кривой амплификации линейный). Порог (порог чувствительности, пороговое значение), который обозначен на рисунке красной прямой, пересекает кривую амплификации в точке наступления экспоненциальной фазы. Порог чуствительности может быть разным для разных видов анализа (если, например, используются разные методики анализа или исследуются разные гены), но всегда одинаковый для всех образцов в одной выборке (или в одном эксперименте).

Суть ПЦР в реальном времени заключается в том, что в каждом цикле реакции количество продукта удваиватся по сравнению с предыдущим. Если, например, значение Ct для двух реакций отличается на 2 цикла (см. рисунок), можно сделать вывод, что в образце А (обозначен фиолетовым графиком) в 4 раза больше копий мРНК, чем в образце Б (обозначен оранжевым графиком).

Чаще всего, данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, позволяют оценить так называемую «относительную экспрессию», то есть, насколько различается интенсивность экспрессии определенного гена у двух организмов. Однако, методика позволяет оценить и абсолютное значение экспрессии генов, но для этого необходимо создать стандарт, в роли которого обычно выступают  клонированные целевые участки кДНК, интегрированные в вектор.

Кому нужно сдать анализ на ПЦР

Любой человек может сдать кровь для исследования. Прямым показанием для исследования является подозрение на инфекции передающиеся половым путем (хламидиоз, гарднереллез, ВИЧ-инфекция). При случайном незащищенный половом контакте только ПЦР поможет поставить диагноз на ранней стадии, если человек заразился каким-либо заболеванием. В обязательном порядке кровь на TORCH-комплекс сдают беременные женщины. А также женщины, только планирующие беременность.

Хотя ПЦР является максимально эффективным методом диагностики, зацикливаться только на нем не стоит. Обследование пациента при любом заболеваний должно носить комплексный подход. Если цепная полимеразная реакция позволяет выявить возбудителя, то серологическое исследование позволяет оценить эффективность лечения, реакцию организма на возбудителя и лекарства. Назначать все исследования должен врач по показаниям.

Увидеть, как выполняется анализ крови ПЦР,  вы сможете, просмотрев данный видео-обзор:

Гудков Роман, врач-реаниматолог

47,937 просмотров всего, 4 просмотров сегодня

Как проводится тест ПЦР?

Для исследования берется любая среда, в которой может находиться возбудитель, но чаще всего используются:

• Кровь сыворотка или плазма – для выявления множества возбудителей – вирусов гепатита B, C, D, G, герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса;
• Моча и сок простаты – при диагностике ЗППП;
• Мокрота, плевральная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж – для диагностики легочных и внелёгочных форм туберкулеза;
• Спинномозговая жидкость – для диагностики инфекций нервной системы;
• Околоплодная жидкость – для определения внутриутробных заражений;
• Мазок из зева – для выявления возбудителей инфекционного мононуклеоза и дифтерии;соскобы и мазки со слизистых  для диагностики ЗППП;клетки слизистой желудка и желудочный сок – для выявления бактерии хеликобактер, вызывающей гастрит и язву.

При одном взятии материала можно обнаружить сразу нескольких возбудителей, попавших в организм. Такая универсальность избавляет пациента от дополнительных обследований и лишних трат.Обнаружить и идентифицировать участки генетической информации удается при помощи специальных эталонных маркеров ДНК (праймеров) созданных для каждого известного возбудителя. Эталон позволяет найти «свой» фрагмент среди миллионов других. Если это происходит, запускается реакция полимеразной цепи.

ПЦР—реакция делает огромное число копий выявленного участка генной информации (репликацию)

Важно, что реплицируются только участки ДНК и РНК, необходимые для проведения анализа. Поэтому так важны чистота эксперимента и умение персонала обращаться с аппаратурой и образцами.Цепная реакция протекает очень быстро, уже через два часа участок ДНК увеличивается в миллионы раз, что позволяет обнаружить и точно идентифицировать инфекцию

Для работы с эталонами пробирки помещают в специальный прибор. При помощи программы задается алгоритм, несколько раз меняющий температуру среды и влияющий на протекание реакции. Результат ПЦР виден сразу после окончания исследования.